Tris-HCl緩沖液用于蛋白純化中需要注意的問(wèn)題
近期，很多實(shí)驗(yàn)室會(huì)在蛋白純化過(guò)程中使用生物緩沖液，此時(shí)挑選適合的緩沖劑就顯得格外重要。很多人會(huì)特別挑選Tris一類(lèi)的，認(rèn)為離子強(qiáng)度低，緩沖能力強(qiáng)，其PH值接近生理范圍，是蛋白的良好溶劑。但其實(shí)Tris-HCl緩沖液也可以用于蛋白純化，只不過(guò)為了保證純化效果，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還是需要注意一些問(wèn)題。
一、注意Tris-HCl的濃度
在純化實(shí)驗(yàn)中確定了緩沖液的pH值和Tris-HCl的緩沖體系，就能知曉它設(shè)定的PH緩沖作用，通常情況下緩沖劑解離常數(shù)pKa在設(shè)定pH值上下一個(gè)單位內(nèi)具有緩沖作用。僅僅只有緩沖范圍和解離常數(shù)復(fù)合遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，另外還需確保緩沖液Tris-HCl的濃度足夠高，才能起到實(shí)際效果，一般濃度為20-100mM。
二、注意Tris-HCl對(duì)溫度的敏感度
Tris系列的緩沖體系對(duì)溫度都比較敏感，比如在25℃時(shí)將Tris-HCl調(diào)至pH為8，pH值將在5℃時(shí)增加到8.58，而在37℃時(shí)降到7.71。因此在4℃條件下保存蛋白或在37℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，就應(yīng)該考慮到室溫下調(diào)的pH值可能在實(shí)驗(yàn)條件中是否適用。
三、注意Tris-HCl緩沖液中的鹽
蛋白純化實(shí)驗(yàn)中用Tris-HCl緩沖液，需要添加氯化鈉以提高鹽濃度，以協(xié)助維持蛋白的可溶性和模擬生理?xiàng)l件，一般常用濃度150mM。離子交換層析進(jìn)行蛋白純化開(kāi)始時(shí)，需降低鹽濃度減少競(jìng)爭(zhēng)，凝膠過(guò)濾柱和Ni2+親和層析柱則需提高濃度。緩沖液體系對(duì)蛋白的活性不會(huì)有干擾，Tris-HCl中不能含有磷酸鹽，否則就會(huì)抑制某些蛋白的活性，反應(yīng)前會(huì)徹底透析掉。
